使用賽默飛abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀要注意哪些細(xì)節(jié)？

使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀時(shí)，需注意以下關(guān)鍵事項(xiàng)以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和設(shè)備的安全運(yùn)行：

一、abi7500 pcr實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、樣本與試劑

使用高質(zhì)量、無污染的DNA/RNA模板和試劑（如引物、探針、Master Mix）。

避免試劑反復(fù)凍融，分裝保存以減少降解風(fēng)險(xiǎn)。

對RNA樣本進(jìn)行DNase處理，并確保cDNA合成質(zhì)量。

2、耗材選擇

使用光學(xué)級(jí)八聯(lián)管或96孔板，確保與儀器適配（如ABI認(rèn)證耗材）。

檢查管蓋是否密封，避免蒸發(fā)污染或信號(hào)干擾。

3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置陰性對照（無模板對照，NTC）和陽性對照，監(jiān)測污染和擴(kuò)增效率。

合理設(shè)計(jì)復(fù)孔（建議至少3個(gè)技術(shù)重復(fù)）以提高數(shù)據(jù)可靠性。

二、abi7500 pcr操作注意事項(xiàng)

1、校準(zhǔn)與維護(hù)

定期進(jìn)行 ROX校準(zhǔn)（針對染料校正）和 光學(xué)校準(zhǔn)（確保熒光信號(hào)穩(wěn)定性）。

清潔樣品槽和光學(xué)部件，避免灰塵或污染物干擾熒光檢測。

2、程序設(shè)置

確認(rèn)反應(yīng)程序（變性、退火、延伸溫度和時(shí)間）與引物/探針匹配。

設(shè)置正確的熒光通道（如FAM、VIC、ROX等），避免信號(hào)串?dāng)_。

3、加樣與上機(jī)

加樣時(shí)避免氣泡（可能影響熒光讀?。x心后再上機(jī)。

確保反應(yīng)板/管在樣品槽中放置平整，避免孔位偏移。

三、數(shù)據(jù)分析與質(zhì)控

1、基線閾值設(shè)置

手動(dòng)調(diào)整基線（Baseline）和閾值（Threshold），確保Ct值準(zhǔn)確。

檢查擴(kuò)增曲線是否平滑，排除異?？祝ㄈ缙鸱暹^早或非特異性擴(kuò)增）。

2、熔解曲線分析（若適用）

確認(rèn)單峰特異性，多峰可能提示引物二聚體或污染。

3、效率評(píng)估

標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率應(yīng)在 -3.1~-3.6 之間（對應(yīng)擴(kuò)增效率90%~110%）。

四、安全與維護(hù)

1、防污染措施

分區(qū)操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)），使用帶濾芯槍頭。

定期用10%漂白劑或乙醇清潔工作臺(tái)。

2、儀器保養(yǎng)

關(guān)機(jī)前清潔樣品槽，定期聯(lián)系工程師進(jìn)行專業(yè)維護(hù)。

避免長時(shí)間連續(xù)運(yùn)行，防止過熱。