試劑盒提取DNA

基因組DNA提取試劑盒簡介

DNA是遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，為了進(jìn)行測(cè)序、雜交、基因表達(dá)、文庫構(gòu)建等試驗(yàn)，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提，因此基因組DNA的提取也是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中重要、基本的操作之一。

Solarbio公司提供各種不同樣品基因組DNA提取試劑盒，如植物、動(dòng)物、細(xì)菌、細(xì)胞、血液、酵母等基因組DNA提取試劑盒。所提取的基因組純度高，片段大小在50kb左右。用戶可根據(jù)需要選用不同的試劑盒來進(jìn)行不同樣品的抽提。

一、基因組DNA提取的原則

1、保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性(因?yàn)檫z傳信息全部儲(chǔ)存在核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基層)。

2、排除其它分子(如蛋白質(zhì)、多糖,、脂類、有機(jī)溶劑等)的污染，使下游試驗(yàn)順利進(jìn)行。

二、基因組DNA提取的原理和方法

DNA與組蛋白構(gòu)成核小體，核小體纏繞成中空的螺旋管狀結(jié)構(gòu)，即染色絲，染色絲再與許多非組蛋白形成染色體。染色體存在于細(xì)胞核中，外有核膜及胞膜。從組織中提取DNA必須先將組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色體釋放出來，同時(shí)去除與DNA結(jié)合的組蛋白及非組蛋白。

1、樣品預(yù)處理

從各種不同來源的樣品(如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)植物組織細(xì)胞等)中提取高純度的基因組DNA，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所成分不同，樣品預(yù)處理方式也不同，以下簡單介紹常用提取材料的預(yù)處理方式，若需詳細(xì)了解，請(qǐng)參考本公司各基因組DNA提取試劑盒說明書。

部分樣品預(yù)處理方式

植物材料液氮研磨

動(dòng)物材料勻漿、液氮研磨

培養(yǎng)細(xì)胞蛋白酶K處理

細(xì)菌溶菌酶破壁

酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨

血液紅細(xì)胞裂解液去紅細(xì)胞

2、細(xì)胞裂解

CTAB法：

適用于植物組織、真菌等。

CTAB是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中(>0.7M NaCl)是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。

SDS法：

適用于細(xì)菌、血液、酵母、動(dòng)物組織、細(xì)胞等。

SDS是一種陰離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞，使蛋白質(zhì)變性、染色體解析。

其它裂解方法：

物理方式：機(jī)械剪切、超聲波破碎、研磨勻漿等

化學(xué)方式：異硫氰酸胍、堿裂解等

酶法：蛋白酶K

3、DNA分離純化

純化要求：

核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶(如核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。

其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、多酚和脂類分子等污染應(yīng)降低到低程度。

排除其它核酸分子的污染，如提DNA時(shí)應(yīng)去除RNA，反之亦然。

純化方法：

細(xì)胞破碎后，常使用吸附材料結(jié)合方法去除雜質(zhì)和純化DNA，主要有硅基質(zhì)材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。因硅基質(zhì)材料可特異吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶劑如酚、氯fang等，使得提取基因組像過濾一樣簡單，因此硅基質(zhì)材料成為大規(guī)模分離純化DNA的通用方法。

硅基質(zhì)材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高鹽低pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料相結(jié)合，在低鹽高pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料脫離的特征。其機(jī)理可能是高濃度鹽離子破壞了硅基質(zhì)水分子結(jié)構(gòu)，形成陽離子橋，當(dāng)鹽被清除后，再水化的硅石破壞了基質(zhì)和DNA之間的吸引力，因而DNA從硅基質(zhì)上被洗脫下來。

注意事項(xiàng)：

盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞。

減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)DNA的降解，為避免過酸、過堿對(duì)DNA雙鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH值4.0-10.0的條件下進(jìn)行。

防止基因組DNA的生物降解，主要是DNase降解基因組DNA，DNase需二價(jià)金屬陽離子如Mg2+等的激活，可用EDTA等金屬離子螯和劑螯和Mg2+以抑制DNase的活性。

減少物理因素對(duì)DNA的降解，物理降解因素主要包括機(jī)械剪切力(如劇烈振蕩、攪拌等)，細(xì)胞突然置于低滲液中導(dǎo)致的細(xì)胞爆炸式破裂，DNase大量釋放，樣品反復(fù)凍融和高溫等。

4、DNA洗脫收集

DNA的洗脫效率取決于以下重要因素：

洗脫液成分：

采用硅基質(zhì)膜吸附的DNA，可將DNA在低鹽高pH值條件下洗脫下來。pH值在7.0-8.5之間洗脫效率較高，pH值低于7.0則洗脫效率很低。一般基因組提取試劑盒中的洗脫緩沖液就是TE(pH8.0)，既為DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫下來提供良好的pH環(huán)境，其中的EDTA又能保證DNA不被DNase降解，同時(shí)由于EDTA濃度非常低，對(duì)核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶的影響非常微弱，不影響后續(xù)試驗(yàn)，可放心使用。

洗脫液體積：

當(dāng)洗脫液體積小于30ul時(shí)，洗脫效率很低且不穩(wěn)定；當(dāng)洗脫液體積在50-200ul時(shí)，洗脫效率穩(wěn)定在80-90﹪，并可保證得到大產(chǎn)量，因此洗脫液體積不能小于30ul。

加洗脫液部位：

100-200ul洗脫液能*覆蓋硅基質(zhì)膜，DNA的洗脫量可得到保證，但當(dāng)洗脫液體積較少如30-50ul時(shí)，須在硅基質(zhì)膜中間部分懸空滴加洗脫液，以確保少量的洗脫液能*覆蓋硅膠膜。

洗脫液的溫度：                                                

在加洗脫液之前，先將洗脫液在60-75℃水浴中預(yù)熱10分鐘，可有效提高DNA的洗脫效率。

洗脫時(shí)間和次數(shù)：

加入預(yù)熱的洗脫液后，可在室溫放置2-5分鐘使DNA*溶解在洗脫液里通過離心而洗脫下來。同時(shí)可進(jìn)行二次或三次洗脫，即將前次洗脫下來的洗脫液再上柱、離心，使前次沒有洗脫下來的DNA再次溶解在洗脫液里，從而提高DNA的產(chǎn)量。

5、DNA的定量及檢測(cè)

提取得到的DNA片段需從分子質(zhì)量、濃度、純度等方面進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷DNA質(zhì)量。

用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA分子質(zhì)量：

得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。Solarbio公司的基因組DNA提取試劑盒提取的不同材料基因組DNA片段大小一般在50kb左右，能很好地滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

通常用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA分子質(zhì)量時(shí)，以溴酚藍(lán)為示蹤染料，EB染色，紫外觀察，并與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照即可判斷所提DNA的平均分子量。高質(zhì)量的基因組DNA應(yīng)顯示為單一條帶，如DNA降解則表現(xiàn)為彌散條帶。

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度：

濃度測(cè)定：

DNA在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。

以下簡單介紹OD260的測(cè)定方法：

所提基因組DNA樣品=100ul

進(jìn)行OD260值測(cè)定的待測(cè)樣品=20ul所提基因組DNA樣品+180ul TE=200ul

DNA稀釋倍數(shù)=200ul/20ul=10倍

如200ul待測(cè)樣品OD260值=0.2

待測(cè)樣品濃度(即100ul基因組DNA樣品濃度)=50ug/ml×OD260值×稀釋倍數(shù)=100 ug/ml

所提100ul基因組DNA樣品總量=100 ug/ml×100ul=10ug DNA

純度測(cè)定：

一般用OD260/OD280值檢測(cè)DNA樣品的純度。正常OD260/OD280值約為1.7-1.9，說明DNA純度較好；若OD260/OD280值小于1.7，說明可能有蛋白污染；若OD260/OD280值大于2.0，說明可能有RNA污染或DNA已經(jīng)降解。

注：因?yàn)閜H值和離子會(huì)影響光吸收值，因此洗脫時(shí)如不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，OD260/OD280值會(huì)偏低，但并不表示純度低。

6、DNA的儲(chǔ)存

儲(chǔ)存溶液：

DNA為兩性解離分子，在堿性條件下較穩(wěn)定，因此一般用TE(pH8.0)保存。TE的成分為：10 mM Tris-HCl(Tris與鹽酸形成強(qiáng)的緩沖對(duì))；1 mM EDTA(乙二胺四乙酸，能螯合二價(jià)金屬陽離子，抑制DNase的活性)；pH8.0(堿性條件可減少DNA的脫氨作用，防止降解)。ddH2O的正常pH值為7.0，可作為DNA的儲(chǔ)存液，但有些試驗(yàn)室制備的ddH2O呈酸性(pH值小于7.0)，這不僅影響DNA的洗脫效率，而且導(dǎo)致長時(shí)間保存的DNA容易發(fā)生降解。因此建議用TE作為DNA的長期儲(chǔ)存液。

儲(chǔ)存條件：

為避免DNA降解，提取的DNA應(yīng)*行分裝，然后置于-20℃或-70℃保存，同時(shí)注意避免反復(fù)凍融造成DNA降解。